Isotermiset nukleiinihappomonistusmenetelmät
10 Moodi 1/2018
malariadiagnostiikassa
TIINA PULLIAINEN
Pulliainen on bioanalyytikko
(YAMK) ja työskentelee
HUSLABin parasitologian
laboratoriossa.
Malariaa on pitkään kutsuttu nimellä
’King of Diseases’ - eikä
turhaan. Vuonna 2015 malariaan
sairastui arviolta 212 miljoonaa
ihmistä, joista 429 000
menehtyi tautiin. Suurimmassa vaarassa ovat
alle 5-vuotiaat lapset. Vuonna 2015 303 000
afrikkalaista lasta ei ehtinyt juhlia viidettä syntymäpäiväänsä.
Varhaisella diagnosoinnilla ja
täsmällisellä hoidolla olisi mahdollista vähentää
tartuntoja ja kuolleisuutta sekä estää lääkkeille
resistentin kannan leviämistä (1). Kenttäolosuhteisiin
siirrettävälle, nopealle, mutta
samalla herkälle malariatestille on tarvetta.
Voisiko isotermisistä nukleiinihappomonistusmenetelmistä
olla ratkaisu ongelmaan?
Malaria ja sen diagnostiikka
Malaria on Plasmodium-loiseläimen aiheuttama
infektiotauti, joka tarttuu hyttysten pistojen
välityksellä. Malarialoisen kypsyminen
hyttysessä ihmistä infektoivaan muotoon, vaatii
olosuhteita, joissa vuorokauden keskilämpötila
on +28 °C tai enemmän. Matkailijoiden
ja maahanmuuton myötä malariainfektioita
tavataan ympäri maailmaa, myös Suomessa.
Yleisimmin tauti on saatu Afrikan matkalta (2).
Parhaat tavat torjua malariaa ovat hyttysten
pistojen ehkäisy myrkytyksin ja suojaharsoin,
estolääkityksellä ja infektioiden varhaisella
diagnosoinnilla (1). Malariarokotetta on
yritetty kehittää jo monta vuosikymmentä, siinä
kuitenkaan vielä onnistumatta (3).
WHO:n suosituksen mukaan malariaepäilyissä
jokaisen henkilön tulee saada pikainen ja
täsmällinen diagnoosi ennen lääkityksen aloittamista.
Pikatestit ovat hyväksyttävä vaihtoehto
alueille, joissa ei ole edellytyksiä mikroskooppiselle
tutkimukselle (WHO, 2017).
Malarian diagnosoinnin kulmakivenä ovat
edelleen perifeerisen veren sively- ja paksupisaranäytteiden
mikroskopointi. Parasiitin löytäminen
ja lajin tunnistaminen vaativat kokemusta
ja hyvän perehdytyksen (4). Mikroskopointi
on tällä hetkellä kustannustehokkain ja
sen avulla on mahdollista havaita 4-20 parasiittiä
millilitrasta verta. Kenttäolosuhteissa
todellisen määrän on arvioitu kuitenkin olevan
50 - 100 parasiittiä millilitrassa (5). Menetelmä
edellyttää kuitenkin osaavan henkilökunnan
ja tulosten tulkinta vaatii aina kahden
työntekijän työpanoksen. Laboratoriovastaus
perustuu aina kahden henkilön mikroskopoinnin
tulokseen.
PCR eli polymeraasiketjureaktio on menetelmistä
herkin, ja se tunnistaa
on 1-5 parasiittiä
millilitrasta verta. PCR
on menetelmistä luotettavin
myös sekainfektioissa,
mutta se on kustannuksiltaan
ja tutkimusolosuhteiltaan
vaativampi
sekä hitaampi menetelmä
kuin muut (5). Hyvän
hoidon takaamiseksi malaria
tulisi todeta parin tunnin
kuluessa näytteenotosta,
johon PCR on liian hidas(
2). PCR-menetelmää
on mahdollista käyttää mikroskopoinnin tukena
epäselvien tapausten selvittelyssä (4).
Pikatestit tarjoavat nopean ja helpon vaihtoehdon
malarian tunnistukseen laboratorion
ulkopuolisissa olosuhteissa. Niiden tunnistusraja
on kuitenkin >200 parasiittiä millilitrassa
verta, eikä tulosten luotettavuus ole samaa
tasoa kuin mikroskopoinnin tai herkän
PCR-menetelmän (5).
Isoterminen nukleiinihappojen
monistusmenetelmä
Isotermiset nukleiinihappomonistustekniikat
ovat helposti kenttäolosuhteisiin siirrettäviä
testejä koska, toisin kuin PCR-menetelmässä,
ja niiden avulla DNA voidaan monistaa tasaisessa
ja melko alhaisessa lämpötilassa. Niistä
onkin toivottu auttajaa malariadiagnostiikkaan
alueille, jossa tautiin sairastuneita on paljon,
mutta ei nykyisten analyysien vaatimia resursseja
ja henkilökuntaa (6). Todennäköisesti
käytetyin näistä on loop-mediated eli silmukkavälitteinen
isoterminen monistusmenetelmä
(LAMP). Se on kehitetty vuonna 2000, ja malariadiagnostiikassa
sitä on alettu käyttää vuodesta
2006 lähtien (7).
Isotermiset nukleiinihappomonistusmenetelmät
kenttäolosuhteissa
Loop-mediated isothermal amplification
(LAMP) on osoittautunut herkäksi ja nopeaksi
menetelmäksi, eikä se
välttämättä vaadi edes sähkönlähdettä.
Pääsääntöisesti
menetelmä vaatii sähköä
vesihauteeseen ja fluoresenssin
lukijaan, mutta
näihinkin on saatu kehitettyä
sähköttömiä vaihtoehtoja.
Markkinoilla on
olemassa myös kannettava,
uudelleen ladattava fluoresenssin
lukija, joka ei vaadi
jatkuvaa sähkönlähdettä
(7). Menetelmä ei ole yhtä
herkkä kuin PCR, mutta
tunnistaa alhaisemman määrän parasiittejä
kuin mikroskopointi tai pikatestit. Se on myös
herkkyytensä takia altis kontaminaatioille, ja
syyt mahdollisiin vääriin positiivisiin tuloksiin
ovat yleensä kontaminoituminen toisella näytteellä
(8). Kuten mikään testi ei tämäkään ole
täysin 100 %:n herkkä tai spesifi tunnistamaan
kaikkia malarialajeja ja sekainfektiota, mutta
on parempi vaihtoehto nykyisille pikatesteille
kenttäolosuhteissa.
Lopuksi
Suomessa malariadiagnostiikka perustuu yhä
verinäytteiden mikroskopointiin, jonka tukena
käytetään PCR-menetelmää. Mikroskopoimalla
on mahdollista tunnistaa samalla monia
muitakin veren parasiittejä, esimerkiksi Trypanosomat,
filaria-madot ja Babesian (4). Uusissa
menetelmissä usein keskitytään yhden parasiitin
analyysin kehittämiseen, joka rajaa pois
muut löydökset. Mikroskopointi on edelleen
hyvä yleistutkimus, mutta se on osaamista ja
tarkkuutta vaativaa työtä. Luoko testien kehittäminen
paineita kliinikoille, joiden tulee osa-
MATKAILULÄÄKETIEDE
Kenttäolosuhteisiin
siirrettävälle, nopealle,
mutta samalla herkälle
malariatestille
on tarvetta.