4/2017 Moodi 31
tiset ongelmat, joissa NGS:ää voidaan parheiten
hyödyntää.
Kliinisessä käytössä pitää ratkaista,
mikä on lääketieteellisesti merkitsevä
löydös, mikä taas merkityksetön, ja mikä
voi tulla merkitseväksi myöhemmin. Vähäisetkin
mikrobisekvenssit, kuten lääkeaineresistentit
kannat, saattavat olla kliinisesti
merkittäviä. Karttuvan tutkimustiedon avulla
merkityksetön tieto voi osoittautua merkitykselliseksi
myöhemmin, esimerkiksi
uuden tautiassosiaation tai uuden hoidon
ansiosta, jolloin kaiken sekvensointitiedon
tallentamiselle on perusteita. Mikrobien
sekvensoinnissa kertyvän humaanisekvenssitiedon
poistaminen paitsi tulkinnallisista,
myös eettisistä syistä lienee välttämätöntä.
Humaanisekvenssien poistamisen menetelmistä
ja laatukriteereistä tulisi olla yhteinen
sopimus.
Massiiviparalleelisekvensoinnin etu ja
haaste on sen kaikkien osa-alueiden nopea
kehitys: näytteenkäsittely, sekvensoitavien
kirjastojen valmistus, sekvensointi ja erityisesti
tulosten analysointi
bioinformatiikan ja tilastotieteen
keinoin kehittyvät
valtavaa vauhtia. Pullonkaulana
on tulosten
tulkinta ja sen hitaus silloin,
kun valmiita tulkinta
algoritmeja ei ole olemassa.
Diagnostisen laboratorion
kannalta uusi
vaatimus on bioinformatiikan
osaaminen, jota
Suomessa on aivan liian
vähän. Osaamisen kehittäminen
on aikaavievää ja
vaatii matemaattista ymmärrystä – ja mikrobiologisista
sekvensoinneista puhuttaessa
mikrobiologian alan taustakoulutusta. Uusia
diagnostisia menetelmiä käyttöön otettaessa
ensimmäinen ilmeinen kysymys on hinta.
NGS on kalliimpaa kuin Sanger-sekvensointi,
mutta hinnat ovat laskusuunnassa.
Laadunarvioinnin näkökulmia
Laadunarvioinnin ja laboratorioiden välisen
tulosvertailun kannalta NGS:n jatkuvasti
uudistuvat laboratoriomenetelmät, sekvensointialustat,
tulkinta-algoritmit ja muut tekniset
ratkaisut ovat äärimmäisen haastavia.
Menetelmien välillä tulee aina olemaan suuria
eroja, jotka kasvavat sitä mukaa, mitä yksityiskohtaisempaa
tietoa tarkastellaan. Hyvin
kuratoituja tietokantoja mikrobilöydösten
vertailuun on vasta vähän saatavilla. Jokaisen
sekvensointituloksen tulkinta perustuu
julkisiin tietokantoihin, jotka karttuvat
ja paranevat ainoastaan sinne lähetettävien
sekvenssien avulla. Siksi on äärimmäisen
tärkeää, että kaikki mikrobisekvenssit lähetetään
julkisiin tietokantoihin kaikkien käytettäväksi.
Diagnostisessa käytössä tärkeintä on pystyä
erottamaan lääketieteellisesti merkitsevä
löydös ja tulkitsemaan sen merkitys. Lopullisen
löydöksen lisäksi NGS-prosessin laatua
voidaan tarkastella osina: näytekäsittelyä,
halutun kohteen tai sekvenssin rikastamista,
sekvensointia ja bioinformaattista datan käsittelyä
kutakin erikseen. Esimerkiksi sekvensoinnin
tuottamaa dataa voidaan käyttää
ulkoisen laadunarvioinnin ”näytteenä”, joka
laboratorion tulee kyetä analysoimaan.
Eettiset kysymykset
Sekvensointitiedon kertyminen tuo mukanaan
eettisiä kysymyksiä mikrobiologiassa
samaan tapaan kuin genetiikassa. Sekvenssitiedon
joukossa voi olla satunnaislöydöksiä,
jotka eivät liity potilaan sairauteen ja
joita ei ole osattu epäillä: esimerkiksi haettaessa
ulostepatogeeneja metagenomiikan
lähestymistavoilla on mahdollista löytää
HIV-sekvenssejä potilaalta, jota ei ole
tiedetty HIV-positiiviseksi. Satunnainenkin
löydös voi olla potilaan
terveyden kannalta merkityksellinen.
On tärkeää sopia etukäteen
menettelytavoista,
jotta satunnaislöydökset
eivät vaikeuta tulosten
tulkintaa liialti. Bioinformatiikan
keinoin epätoivottua
sekvenssidataa
voidaan suodattaa pois
ennen raportin laatimista.
Satunnaislöydökset eivät
ole yksinomaan NGS:n sivutuote.
Esimerkiksi MRI-
ja CT-kuvauksissa voidaan todeta syöpä
muussa tarkoituksessa tehdyn tutkimuksen
sivutuotteena. Genetiikassa ihmisen eksomi-
tai kokogenomisekvensoinnin yhteydessä
voidaan löytää lukuisia loss-of-function-mutaatioita,
joista osa voi liittyä tunnettuihin perinnöllisiin
tauteihin. Sekä potilaan että hoitavan
lääkärin tulee olla tietoinen tällaisesta
mahdollisuudesta.
Mikrobisekvenssitiedon tallentamista voidaan
perustella sillä, että tällä hetkellä merkityksetön
sekvenssitieto saattaa tulla tärkeäksi,
jos löydetään uusia tautiassosiaatioita
tai kehitetään uusia lääkkeitä tai rokotteita.
Erityisesti shotgun-sekvensoinnissa kertyvän
humaanisekvenssitiedon osalta tilanne
on toinen. Kysymys humaanitiedon käsittelystä
ja tallentamisesta silloin, kun se ei ole
ollut tutkimuksen kohteena, edellyttää laboratoriodiagnostiikan,
lääketieteen, muiden
terveydenalan toimijoiden ja etiikan asiantuntijoiden
välistä keskustelua.
Lopuksi
Massiiviparalleelisekvensointi mahdollistaa
laajan, oireisiin perustuvan laboratorio-
diagnostiikan jopa yksittäisistä näytteistä.
Tärkeitä diagnostisia sovellusalueita ovat
esimerkiksi lääkeaineresistenssien toteaminen
ja vaikeiden, harvinaisten tautitapausten
diagnostiikka. Metagenomiikan
lähestymistavat helpottavat uusien tauti-
assosiaatioiden ja kokonaan uusien patogeenien
löytämistä. Mikrobiomin merkityksen
selvittämiseen NGS on ainutlaatuinen
työkalu. Löydöksiä voidaan hyödyntää lääkkeiden
ja rokotteiden sekä mikrobien kasvatusmenetelmien
kehittämisessä. NGS:llä
saadaan valtavasti tietoa, jonka tulkinta on
haasteellista, mutta joka tuo mukanaan myös
uusia diagnostisia mahdollisuuksia.
KIRJALLISUUSVIITTEET
1. Briese T, Kapoor A, Mishra N, Jain K, Kumar A, Jabado OJ,
Lipkin WI. Virome capture sequencing enables sensitive
viral diagnosis and comprehensive virome analysis. MBio.
2015 Sep 22;6(5):e01491-15. doi: 10.1128/mBio.01491-15.
2. Schmidt K, Mwaigwisya S, Crossman LC, Doumith M,
Munroe D, Pires C, Khan AM, Woodford N, Saunders NJ,
Wain J, O’Grady J, Livermore DM. Identification of bacterial
pathogens and antimicrobial resistance directly from
clinical urines by nanopore-based metagenomic sequencing.
J Antimicrob Chemother 72:104–14, 2017.
3. Naccache SN, Peggs KS, Mattes FM, Phadke R, Garson
JA, Grant P, Samayoa E, Federman S, Miller S, Lunn MP,
Gant V, Chiu CY. Diagnosis of neuroinvasive astrovirus infection
in an immunocompromised adult with encephalitis
by unbiased next-generation sequencing. Clin Infect
Dis 60:919-23, 2015.
4. Zhao J, Liu J, Vemula SV, Lin C, Tan J, Ragupathy V, Wang
X, Mbondji-Wonje C, Ye Z, Landry ML, Hewlett I. Sensitive
detection and simultaneous discrimination of influenza
A and B viruses in nasopharyngeal swabs in a
single assay using next-generation sequencing-based
diagnostics. PLoS One. 2016 Sep 22;11(9):e0163175. doi:
10.1371/journal.pone.0163175. eCollection 2016.
5. Hanski I, von Hertzen L, Fyhrquist N, Koskinen K, Torppa
K, Laatikainen T, Karisola P, Auvinen P, Paulin L, Mäkelä
MJ, Vartiainen E, Kosunen TU, Alenius H, Haahtela T.
Environmental biodiversity, human microbiota and allergy
are interrelated. Proc Natl Acad Sci USA 109:8334-
9, 2012.
6. Kelhälä HL, Aho V, Fyhrquist N, Pereira P, Kubin M, Paulin
L, Palatsi R, Auvinen P, Tasanen K, Lauerma A. 2017. Isotretinoin
and lymecycline treatments modify the skin microbiota
in acne. Exp Dermatol. 2017 Jun 21. doi: 10.1111/
exd.13397. Epub ahead of print
7. Scheperjans F, Aho V, Pereira PAB, Koskinen K, Paulin L,
Pekkonen E, Haapaniemi E, Kaakkola S, Eerola-Rautio
J, Pohja M, Kinnunen E, Murros K, Auvinen P. Microbiota
are related to Parkinson’s disease and clinical phenotype.
Mov Disord 30:350-8, 2015.
8. Pereira PAB, Aho VTE, Paulin L, Pekkonen E, Auvinen P,
Scheperjans F. Oral and nasal microbiota in Parkinson’s
disease. Parkinsonism Relat Disord 38:61-7, 2017.
9. Seppälä H, Virtanen E, Saarela M, Laine P, Paulín L, Mannonen
L, Auvinen P, Auvinen E. Single-molecule sequencing
revealing the presence of distinct JC polyomavirus
populations in patients with progressive multifocal leukoencephalopathy.
J Infect Dis 215:889-95, 2017.
10. Seppälä HM, Helanterä IT, Laine PK, Lautenschlager
IT, Paulín LG, Jahnukainen TJ, Auvinen PO, Auvinen E.
Archetype JC polyomavirus prevails in a rare case of JC
polyomavirus nephropathy and in stable renal transplant
recipients with JC polyomavirus viruria. J Infect Dis. 2017
Aug 22. doi: 10.1093/infdis/jix435.
Massiiviparalleelisekvensointi
mahdollistaa laajan,
oireisiin perustuvan
laboratoriodiagnostiikan
jopa yksittäisistä
näytteistä.