4/2017 Moodi 29
sekvenssien pituudet ovat varsin lyhyitä, noin
150–300 emästä. Luotettavaan diagnostiikkaan
vaaditaan tavallisesti suuri määrä sekvenssejä.
Edellä mainituilla laitteilla voidaan
tehdä kohdennettua sekvensointia, kuten 16S
rRNA-geeniin perustuvaa bakteeritunnistusta
tai virusgenomin tietyn osan sekvensointia
genotyypitystä varten. Laitteet sopivat myös
metagenomiikan shotgun-sovelluksiin, joissa
tarvitaan suuria määriä sekvenssejä. Uudemmilla
PacBio RSII -laitteella (Pacific Biosciences
of California Inc.) ja MinION-laitteella
(Oxford Nanopore Technologies) analysoidaan
yksittäisiä DNA-molekyylejä ilman
klusterointia. Saavutetut lukupituudet
ovat kymmenistä tuhansista jopa satoihin tuhansiin
emäksiin. Klustereita käyttävissä tekniikoissa
emäskohtainen virheen todennäköisyys
on ≤ 1 %, kun taas yksittäisiä molekyylejä
sekvensoivissa tekniikoissa raakadatan
virheprosentti on 13–15 %. Kun esimerkiksi
PacBio-laitteella samaa sekvenssijaksoa
sekvensoidaan tuhansia kertoja, saatavan
konsensus-sekvenssin tarkkuus on erittäin
korkea. Laskennallisesti noin 20 lukukerran
jälkeen PacBion emäskohtainen tarkkuus
on parempi kuin Illuminan.
Kaikilla NGS-laitteilla on omat käyttöalueensa.
On tärkeää valita NGS-menetelmä
diagnostisen kysymyksenasettelun ja
halutun datan luonteen mukaan. NGS-laitteiden
kehitysvauhti on ollut poikkeuksellinen.
Viimeisten kymmenen vuoden aikana
DNA-sekvensoinnin nopeus on kasvanut
enemmän kuin tietokoneiden laskentakapasiteetti
on lisääntynyt, mutta kustannukset
ovat laskeneet. Uusien NGS-laiteversioiden
ja kokonaan uusien laitteiden julkistamistahti
vie alaa eteenpäin, mutta haittapuolena on
menetelmien standardisoinnin vaikeus diagnostiikkaa
varten.
Sekvensoinnin lähestymistapoja
Diagnostisissa sekvensoinneissa on kaksi
pääasiallista lähestymistapaa. Sekvensointia
voidaan tehdä kohdennetusti, jos tiedetään
mitä halutaan etsiä ja sekvenssitietoa on
käytettävissä. Tällöin kohdetta tavallisesti rikastetaan
ensin PCR-monistuksella spesifeillä
alukkeilla tai viljelemällä. Kohdennetussa
sekvensoinnissa sekvenssidata on vähemmän
kompleksista ja haluttu sekvenssi on rikastuneena.
Sekvenssidatan bioinformaattinen
käsittely on helpompaa, ja automaattisia
tulkinta-algoritmeja on mahdollista kehittää.
Esimerkkejä kohdennetusta sekvensoinnista
on bakteerien osoittaminen ja tyypittäminen
16S rRNA-geenin avulla tai antibioottiresistenssigeenien
määrittäminen.
Virologiassa kohdennettua sekvensointia
käytetään virusten tyypitykseen, lääkeaineresistenssien
määrittämiseen tai resistenttien
kantojen varhaiseen toteamiseen nopeasti
muuntuvilla viruksilla. Kohdennettu
sekvensointi voi olla myös hyvin laajaa. Koko
viromin analyysissä Briese ym. syntetisoivat
kaksi miljoonaa oligonukleotidikoetinta, jotka
kattoivat kaikki tunnetut selkärankaisten
virukset yhteensä 207 taksonomisesta ryhmästä
(1). Koettimilla pyydystettiin eristetyistä
näytteistä virusten nukleiinihapot, ja
ne monistettiin ja sekvensoitiin. Tällä lähestymistavalla
voitiin löytää uusia viruksia erittäin
kompleksisista näytemateriaaleista ja
herkistää tavanomaisen NGS:n herkkyyttä
vielä 100–10 000-kertaiseksi.
Shotgun-sekvensointi tulee kyseeseen silloin,
kun sekvensoinnin kohde ei ole tiedossa,
kun halutaan sekvensoida mahdollisimman
kattavasti, tai kun sekvenssitietoa ei ole
saatavilla. Shotgun-sekvensointia voidaan
käyttää mikrobipopulaatioiden karakterisoimiseen,
uusien patogeenien hakemiseen tai
etiologisen tekijän tunnistamiseen silloin,
kun sitä ei tavanomaisilla menetelmillä löydetä.
Harvinaisten vaikeiden tautitapausten
etiologian selvittelyssä shotgun-sekvensointi
voi tulla kyseeseen, esimerkiksi henkeä
uhkaavissa enkefalopatioissa, joissa taudinaiheuttajaa
ei löydetä tavanomaisin diagnostisin
menetelmin. Shotgun-sekvensoinnin
erityisiä haasteita on sivutuotteena kertyvän,
kysymyksenasettelun kannalta tarpeettoman
sekvenssitiedon suuri määrä. Näytteestä ja
lähestymistavasta riippuen jopa 99 % shotgun
sekvensoinnilla saatavasta sekvenssidatasta
voi edustaa humaanisekvenssejä. Spesifin
sekvenssitiedon suodattaminen ja analysointi
vaatii suurta tietokonekapasiteettia
ja laajaa bioinformaattista osaamista ja on
vaikeasti automatisoitavissa.
NGS:n sovellusalueita
mikrobiologisessa diagnostiikassa
On selvää, että valtaosa uusista mikrobiologisen
diagnostiikan sovelluksista keskittyy
nukleiinihappojen osoittamiseen. Tämän hetken
kehitystyössä voidaan erottaa konventionaalisten
PCR-menetelmien ohella kaksi megatrendiä:
toisaalta mahdollisimman nopeat
ja varsin suppeat vieri- ja muut pikatestit, ja
toisaalta haluttaessa hyvin laajan mittakaavan
NGS, joka vielä paljolti hakee käytännön
diagnostisia sovelluksia. Tietojemme mukaan
Suomen kliinisissä laboratorioissa ei toistaiseksi
käytetä NGS-menetelmiä mikrobiologisessa
potilasdiagnostiikassa. Taulukossa 2
esitetään niitä NGS-sovelluksia, joita on käytössä
joissakin Euroopan maissa, joita suunnitellaan
käyttöön, tai jotka teknisesti olisivat
lähitulevaisuudessa toteutettavissa diagnostiikassa.
Ensimmäisinä käyttöön ovat tulleet tai tulossa
sellaiset diagnostiset sovellukset, joissa
jo käytetään Sanger-sekvensointia. 16S
rRNA-geeniin perustuva bakteerien tyypitys
tehdään jo NGS:llä useissa laboratorioissa
Pohjoismaissa. Kokogenomisekvensointia
käytetään tai kokeillaan uusien MRSA-kantojen,
invasiivisten meningokokkien ja gonokokkien
tyypitykseen sekä antibioottiresistenssimäärityksiin.
Bakteeripatogeeneja
ja useita resistenssigeenejä on onnistuttu
sekvensoimaan virtsanäytteistä jopa ilman
bakteerien rikastamista viljelyllä (2).
NGS:ää käytetään myös silloin, kun halutaan
varmistaa harvinainen bakteerilöydös, tai
kun näyte on jäänyt bakteeriviljelyssä negatiiviseksi,
mutta on vahva epäilys bakteerietiologiasta.
Bakteerien patogeenisten determinanttien,
kuten virulenssi- ja toksiinigeenien
osoittaminen on yksi NGS:n sovellus.
Harvinainen metagenomiikan sovellus
mikrobidiagnostiikassa voisi tulevaisuudessa
löytyä C. difficile -antibioottiripulin
hoitoon tehtävistä ulosteensiirroista, joissa
potilaan suoleen siirrettävän ulosteen lajikoostumus
selvitetään terveen mikrobiomin
karakterisoimiseksi ja myös patogeenien
poissulkemiseksi.
Sienipatogeenien tunnistamisessa Sanger
sekvensoinnin avulla hyödynnetään homologisia
18S/28S sRNA-geenejä. NGS-sekvensoinnissa
käytetään lyhyempiä ja tarkan
tunnistamisen mahdollistavia ITS (internal
transcribed spacer) -alueita. NGS:n käytöstä
sienidiagnostiikassa on vielä varsin vähän
kokemusta.
Sekvenssi Osuus alkuperäisessä
näytteessä
Osuus
Sanger-readeistä
Osuus NGS-readeistä
----------AA---------- 80 % Pääosa 80 %
----------AT---------- 12 % Pieni signaali 12 %
----------GC---------- 4 % - noin 4 %
----------TT---------- 2 % - noin 2 %
----------CG---------- 1 % - noin 1 %
----------TA---------- 1 % - noin 1 %
Taulukko 1. Sekvenssivarianttien erottelukyky Sanger- ja NGS-sekvensoinnilla. Saatuja
sekvenssiosuuksia kuvaavat luvut ovat viitteellisiä ja vaihtelevat lähestymistavasta riippuen.
Jatkuu seuraavalla sivulla